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SDS-PAGE原理步骤蛋白表达系统专题关于凝胶的一些问题
发布时间:2022-07-12 11:24:17 浏览 228次 巩义市维纳净水材料有限公司

SDS-PAGE电泳常见问题(FAQ)分析

SDS-PAGE的原理步骤

蛋白质表达系统专题

1.关于凝胶的一些问题

胶水凝结不好。例如,浓度高的胶在冬季气温低时,分离胶的下部会出现波浪状的花纹,凝胶不均匀。解决方法:增加过硫酸铵的用量,使其凝固更快。同时,清洗玻璃板,防止玻璃板上残留的胶水变干。如果凝胶不凝固,解决方法:在低温时增加过硫酸胺和过硫酸胺的用量。过硫酸胺必须新鲜制备。如果仍然不起作用,请重新配制缓冲溶液。胶水易碎,例如,在染色和脱色过程以及扫描过程中,较高浓度的胶水会破裂。解决方法:首先上述过程中动作一定要轻柔,其次室温较高时可适当减少胺过硫酸盐和胺的用量。电泳后,凝胶上有许多长条。解决方法:建议不要回收电泳缓冲液。制备胶水的溶液必须是纯净的。 2.凝胶时间错误

通常胶水会在 30 分钟到 1 小时内凝固。如果凝血太慢,可能是AP剂量不够。如果凝固太快,可能是AP的量和量太多了。这时候凝胶太硬容易开裂,电泳时凝胶容易烧焦。

3.浓缩胶及分离断胶及板间气泡对电泳的影响

前者主要是梳子用力不均或拉力过大造成的;后者是由于制胶夹松开后板子未受压而进入空气造成的,一般对电泳结果影响不大。影响。

4.样品处理

根据样品分离目的的不同,处理方法主要有3种:还原SDS处理、非还原SDS处理、烷基化还原SDS处理。

还原 SDS 处理:在样品中加入 SDS 和 DTT(或 Beta 巯基乙醇)后,会形成 SDS 和蛋白质结合分子。烷基化还原SDS处理:胺碘乙酸烷基化可以很好地保护SH基团,导致窄带;此外聚丙烯酰胺凝胶电泳图,胺碘乙酸可以捕获过量的 DTT 并防止纹理现象的产生。向样品缓冲液中加入 % 碘乙酸铵并在 25°C 下保存。非还原性SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品一般只在1% SDS沸水中煮沸3分钟,不添加还原剂,因此蛋白质折叠不被破坏,不能用于分子量决心。 5.条带两侧凸起,中间凹陷的原因(︶)

在较厚的凝胶中,由于凝胶冷却不均匀,中间部分不能很好地固化。

电泳系统温度高。

处理方法:待其完全凝固后再进行后续实验。

6.条带两侧向下和中间凸起的原因(︵)

一般原因是两板底部间隙的气泡没有清除干净,或者聚合不完全。

处理方法:可在两板之间加入适量缓冲液去除气泡。

7.条带偏斜

原因:电极不平衡或上样位置歪斜。

8.条带两边展开

原因:添加的样本过多。

9.电泳条带太粗

在电泳中看到较粗的条带是很常见的,主要是由于堆积凝胶。

处理方法:适当增加浓缩胶的长度;确保浓缩胶储存液的 pH 值正确;适当降低电压。

10.凝胶浓度选择不当导致目标蛋白条带电泳模糊。 10Kd以下的小分子蛋白应使用胶水。靠近前沿的波段分辨率很差。根据分子量与凝胶孔径的关系,选择合适的凝胶浓度。蛋白质样品的水解。小心去除蛋白质样品中的内源性水解酶,不要反复冻融。电泳时间过长或过短。当溴酚蓝到达分离胶底部时,应关闭电泳电源。缓冲溶液和 SDS 应新鲜制备。避免添加过多的样本并提高分辨率。小体积样品可给出窄带,可根据样品浓度和凝胶厚度灵活控制样品体积。一般上样量为10-15uL(即2-10ug蛋白)。加热变性的蛋白质样品应置于室温下进行电泳,不宜长时间存放,因为蛋白质的二硫键在高温下可能会断裂,但暴露在空气中降温会重新形成二硫键,可能会过热。蛋白质在长期储存过程中可能会重新折叠,不要将它们储存在冰箱中。 11.“鬼带”的出现与处理

“鬼带”是在运行复杂构象的蛋白质大分子时聚丙烯酰胺凝胶电泳图,在泳道顶部出现一些未知条带或在样品孔底部形成沉淀,这主要是由于还原剂在运行过程中被氧化失活所致。加热过程,使解离的蛋白质分子重新折叠并重新结合亚基,导致未知条带或沉淀物,因为它们的分子量通常大于目标条带。

处理方法:加热煮沸后,加入适量的DTT或β-巯基乙醇补充不足的还原剂;或加入适量的EDTA,防止还原剂氧化。

12.拖尾

主要是样品溶解不良或分离胶浓度过高所致。

处理方法:加样前离心;选择合适的样品缓冲液,加入适量的样品促进剂;如果时间过长,重新配制电泳缓冲液;降低凝胶浓度。

13.纹理现象

主要由样品中的不溶性颗粒引起。

处理方法:加样前离心;加入适量的样品促进剂。

14.溴酚蓝不能作为指示剂

在我们的实验中,有时溴酚蓝已经从板底流出,但蛋白质还没有流下来。

主要原因:缓冲液和分离胶浓度过高。

处理:更换正确的pH值;降低分离胶浓度。

15.甘氨酸在电极缓冲液中的作用

SDS-PAGE中的样品溶液和浓缩胶为TRIS/HCL缓冲液,电极溶液为TRIS/甘氨酸。电泳开始后,HCL 解离成氯离子,甘氨酸解离成少量甘氨酸离子。蛋白质带负电,因此一起向正极移动,氯离子最快,甘氨酸离子最慢,蛋白质居中。电泳开始时,氯离子的迁移率最大,超过蛋白质,所以在后面形成一个低电导区,电场强度与低电导区成反比,导致较高的电导率。场强,使蛋白质和甘氨酸离子快速移动非离子聚丙烯酰胺,形成一个稳定的界面,使蛋白质在移动界面附近聚集,凝聚成中间层。

16.电泳电压高但电流低

现象:电压在50v以上,但电流在5mA以下。

主要原因:电泳槽组装不当,电流未形成通路。包括:内外罐倒装;外罐太小等

处理方法:正确组装电泳槽。

17.如何提高SDS-PAGE电泳的分辨率

使 聚丙烯酰胺 充分聚合以提高凝胶的分辨率。

建议做法:凝胶在室温下凝固后,可以在室温下使用一段时间。避免即用型或放入冰箱,前者容易导致固化不充分,后者容易导致SDS结晶。

18.电泳时间比正常时间长

可能是因为凝胶缓冲体系和电极缓冲体系的pH选择不正确,即缓冲体系的pH与被分离物质的等电点相差过小,或者离子缓冲系统强度过高。

19.凝胶制备缓冲体系对电泳的影响

电泳期间缓冲液的主要功能是保持适当的 pH 值。电泳时,正极和负极都会发生电解反应,正极是氧化反应,负极是还原反应。长期电泳会使正极呈酸性,负极呈碱性。缓冲液可以保持两极溶液的 pH 值基本不变。在浓缩胶中,pH环境为弱酸性,甘氨酸的解离非常小,迁移效率低;而CL离子很高,两者之间形成了一个电导率低的区域,蛋白质分子在两者之间。游来游去,聚集在一起,凝聚成一个狭窄的区域。因此,pH对整个反应体系的影响非常重要。如果在实验中排除其他因素后问题不能很好地解决,首先要考虑这个因素。

更多蛋白表达系统技术难点,请参考蛋白表达专题

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    TAG:电泳 蛋白电泳 浓缩胶

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