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聚丙烯酰胺垂直板电泳是什么意思?效应有哪些?
发布时间:2022-07-13 15:07:09 浏览 228次 巩义市维纳净水材料有限公司

2。分子筛效应

当不同分子量或分子大小、形状的蛋白质通过一定孔径的分离胶时,被不同程度的阻隔,表现出不同的流动性,这就是分子筛效应。

经过上述浓缩作用,快、慢离子和蛋白质均进入具有相同孔径pH8.9的分离凝胶。此时高电压消失,在均匀的电压梯度下,由于甘氨酸解离度增加,分子量小,有效迁移率增加,赶超各种血清蛋白。因此聚丙烯酰胺凝胶电泳图,当各种血清蛋白进入相同孔径的小孔凝胶时,分子迁移速度与分子量的大小和形状及其流动性密切相关。分子量小、呈球形的蛋白质分子阻力小、运动快、走在前面;相反,阻力大,运动慢,走在后面,使各种蛋白质被凝胶的分子筛作用分成各自的区域。这种分子筛效应不同于凝胶柱色谱中的分子筛效应,大分子先从凝胶颗粒之间的间隙流出,小分子后流出。

3。电荷效应

虽然各种血清蛋白在浓缩胶和分离胶的界面处高度浓缩,但它们会分层堆积形成狭窄的高浓度蛋白区,但当进入pH8.9的分离胶时, 各种血清蛋白 蛋白质具有不同的净电荷和不同的迁移率。表面电荷越高,迁移越快;否则,越慢。因此,各种蛋白质根据其电荷、分子量和形状,按一定顺序排列成圆盘状区域,称为圆盘电泳。

目前,连续PAGE系统也被广泛使用。电泳时虽然没有浓度效应,但利用分子筛和电荷效应可以更好地分离样品。 、核酸等活性物质的变性和失活,也显示出其优越性,常被科学家采用。

聚丙烯酰胺垂直板电泳是在圆盘电泳的基础上建立起来的。两种电泳原理完全相同,只是填充凝胶的方式不同。凝胶不是填充在玻璃管中,而是填充在嵌入橡胶框架凹槽中的2块不同长度的平行玻璃板之间的间隙中。并且可以调整间隙。胶框一般有0.5mm、1.5mm、3mm三种。前两种多用于分析鉴定,后一种常用于制备。垂直板电泳比圆盘电泳更有优势:

(1)表面积大而薄,方便通过冷却水降低热效应,带材更清晰。

(2)在同一块凝胶板上,可同时对10个以上的样品进行电泳,便于在相同条件下进行对比分析鉴定,也可用于印迹转移电泳和放射自显影。

(3)橡胶片制作简单,易剥离,样品用量少,分辨率高,既可用于分析,也可用于制备。

(4)胶板薄而透明聚丙烯酰胺凝胶电泳图,电泳染色后可制成干板,便于长期保存和扫描。

(5)可以进行二维电泳

在纸或醋酸纤维素薄膜电泳上,血清蛋白只能分离5到6个条带,而以上两种形式的聚丙烯酰胺电泳可以分离几十个条带。广泛应用于科研、农业、医药、临床诊断等分析和制备,如蛋白质、酶、核酸、血清蛋白、脂蛋白的分离,病毒和细菌提取物的分离。

三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

各种蛋白质因其净电荷、分子量和形状而具有不同的迁移率。为了消除净电荷对迁移率的影响,聚丙烯酰胺浓度梯度电泳可以利用由其形成的不同孔径所引起的分子筛效应来分离蛋白质。十二烷基硫酸钠(sμ,简称SDS)也可以加入到整个电泳体系中,其电泳迁移率主要取决于分子量,与净电荷和形状无关。这种电泳方法称为SDS-PAGE。

SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理:SDS是一种阴离子去污剂。当单体浓度为0./L以上时,蛋白质和SDS可以结合成复合物;当SDS单体浓度高于/L时,与大多数蛋白质的平均结合比为1.4g SDS/1g蛋白质;当浓度低于0./L时聚氯化铝,其结合比一般为0.4g SDS/1g蛋白。由于SDS带有大量的负电荷,当它与蛋白质结合时,它所携带的负电荷大大超过了天然蛋白质的原始负电荷,从而消除或掩盖了不同类型蛋白质之间原始电荷的差异,所有带相同的负电荷。负电荷的密度,从而允许通过分子量差异来分离各种蛋白质。在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇,巯基乙醇可以还原蛋白质分子中的二硫键,将多肽组分分解成单个亚基。 SDS可以破坏蛋白质的氢键和疏水键,所以它与蛋白质结合后,也会引起蛋白质构象的变化。配合物的流体动力学和光学性质均表明它们在水溶液中的形状近似于雪茄形长方形棒。不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同,约为1.8nm,而长轴变化与蛋白质的分子量成正比。基于以上两种情况,凝胶电泳中蛋白质-SDS复合物的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只与椭圆棒的长度有关,椭圆棒的长度是分子的函数。蛋白质的重量。

进行SDS-PAGE时,可以利用已知分子量的蛋白质的电泳迁移率和分子量的对数绘制标准曲线,然后根据蛋白质的电泳迁移率得到分子量。未知蛋白质。该方法测定蛋白质分子量具有设备简单、操作方便、样品用量少、耗时少(仅1天)、分辨率高、重复性好等优点。因此,它得到了广泛的应用和发展。它不仅用于蛋白质分子量测定,还用于蛋白质混合组分的分离和亚组分的分析。蛋白质经SDS-PAGE分离后,可将各种蛋白质从凝胶中洗脱下来,去除SDS,进行氨基酸序列、酶解图谱和抗原特性的研究。

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