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关于聚丙烯酰胺凝胶上的一些问题
发布时间:2022-05-13 16:26:25 浏览 138次 巩义市维纳净水材料有限公司

几乎所有的蛋白质电泳分析都是在 聚丙烯酰胺 凝胶上进行的,所有条件都必须始终确保蛋白质解离成单独的多肽亚基,并可能减少它们彼此的聚集。最常用的技术是 SDS-PAGE 电泳。我们来讨论一下你在这个过程中经常遇到的问题:

Q:SDS-PAGE电泳的基本原理是什么?

答:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是将SDS(十二烷基硫酸钠)引入聚丙烯酰胺凝胶系统。SDS 会与变性的多肽相互作用,使蛋白质带负电荷。与SDS结合的多肽量几乎总是与多肽的分子量成正比,与其序列无关,因此丙烯酰胺凝胶电泳中SDS-多肽复合物的迁移率只与多肽的大小有关。革兰氏多肽可与1.4g 去污剂结合使用。当分子量在15KD~15KD之间时,蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系,符合下式:=K-bX,其中MW为分子量,X为迁移率,k 和 b 是常数,如果将已知分子量的标准蛋白质的迁移率与分子量的对数作图,则可以获得标准曲线。未知蛋白质在相同条件下电泳,根据其电泳迁移率在标准曲线上计算分子量。

问:凝胶制备缓冲系统如何影响电泳?

A:SDS-PAGE非连续电泳中,凝胶制备缓冲液采用Tris-HCL缓冲体系,浓缩胶pH6.7,分离胶pH8.9;Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,pH环境为弱酸性,甘氨酸的解离非常小,在电场作用下迁移效率低;而CL离子很高,两者之间形成了一个低电导率的区域。聚丙烯酰胺凝胶电泳作图,蛋白质分子在两者之间游动。由于电导率与电场强度成反比,这个区域形成了一个更高的电压剃须聚丙烯酰胺凝胶电泳作图,将蛋白质分子压在一起并凝结成一个狭窄的区域。当样品进入分离胶时,由于胶内pH值升高,呈碱性,甘氨酸大量解离,迁移率增加,直接跟随氯离子。分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

因此,pH对整个反应体系的影响非常重要。如果在实验中排除其他因素后不能很好地解决问题,则应首先考虑该因素。

问:样品如何处理?

A:根据样品分离目的的不同,处理方法主要有3种:还原SDS处理、非还原SDS处理、烷基化还原SDS处理。

1、还原SDS处理:在样品中加入SDS和DTT(或β-巯基乙醇)后,蛋白质构象解离,电荷被中和,形成SDS-蛋白质结合分子。在电泳中,只能根据分子量进行分离。通常,以这种方式处理电泳。将样品稀释至适当浓度,加入样品中,离心,在沸水中煮沸。

5min,然后离心加入样品。

2、烷基化还原性SDS处理:碘乙酸胺烷基化可以很好、很牢固地长时间保护SH基团,产生窄带;设置多余的 DTT 以防止在银染过程中出现纹理现象。在 100 μl 样品缓冲液中加入 10 μl 20% 胺碘乙酸盐,并在室温下孵育。

3、非还原性SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品一般只在1% SDS沸水中煮3分钟,不添加还原剂,因此蛋白质折叠不被破坏,不能被还原。用于分子量测定。

问:主要成分在SDS-PAGE电泳胶中的作用?

A:聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体,其凝固作用直接关系到电泳的成败,与凝固剂和环境密切相关;

凝胶制备缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择tris-HCL体系,具体功能后面会介绍;

与AP:促凝血,加速聚丙烯酰胺的凝血;

十二烷基硫酸钠 (SDS):一种具有四种功能的阳离子去污剂:去除蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白质分子内的疏水相互作用以及去除多肽折叠。

问:如何提高 SDS-PAGE 电泳的分辨率?

A:充分聚合1、聚丙烯酰胺可以提高凝胶的分辨率。推荐做法:凝胶在室温下凝固后,可以在室温下使用一段时间。避免即用型或4度冰箱放置,前者易导致固化不充分,后者易导致SDS结晶。一般凝胶在室温下可以保存4天,SDS可以水解聚丙烯酰胺。

2、常用的三种染料是氨基黑、考马斯亮蓝和银染。不同的染料有不同的染色方法。详见郭耀军主编的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

Q:“微笑”(两侧凸起聚丙烯酰胺价格,中间凹陷)是什么原因?

A:主要是凝胶中间部分凝固不均匀,多发生在较厚的凝胶中。

处理方法:待其充分凝固后再进行后续实验。

问:“皱眉”(两边中间往下)是什么原因?

A:主要发生在蛋白质立式电泳槽中。一般不会去除两块板之间的底部间隙中的气泡。

处理方法:可在两板之间加入适量缓冲液,去除气泡。

问:为什么皮带有污点?

A:主要是样品熔融效果不好或分离胶浓度过高造成的。

处理方法:加样前离心;选择合适的样品缓冲液,加入适量的样品促进剂;如果时间过长,重新配制电泳缓冲液;降低凝胶浓度。

问:为什么腰带看起来有质感?

A:主要是样品中的不溶性颗粒造成的。

处理方法:加样前离心;加入适量的样品促进剂。

问:什么是“鬼带”,如何处理?

A:“鬼带”是指运行具有复杂大分子构象的蛋白质分子时,常出现在泳道顶部(有时在浓缩胶中)的一些未知大分子带,或者样品孔底部有沉淀. 在加热过程中被氧化失去活性,使原来解离的蛋白质分子重新折叠结合,亚基重新缔合,聚合成分子量大于目标条带的大分子,有时不能进入分离凝胶。但是,它在靶带具有相同的免疫活性,在WB反应中可以看出它可以与靶带对应的抗体一起发挥作用。

处理方法:加热煮沸后,加入适量的DTT或β-巯基乙醇补充不足的还原剂;或加入适量的EDTA,防止还原剂氧化。

问:为什么溴酚蓝不能起到指示作用?

A:在我们的实验中,经常会遇到溴酚蓝已经跑出板底,但蛋白质还没有跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理方法:更换正确的pH值;降低分离胶的浓度。

问:为什么电泳带这么粗?

A:电泳中条带很粗是很常见的,主要是因为浓度不够。

处理:适当增加浓缩胶的长度;确保浓缩胶储存液的pH值正确(6.7);适当降低电压;

问:为什么电泳电压高,电流低?

A:这种现象一般初学者很容易出现。例如,电压在 50v 以上,但电流在 5mA 以下。主要是因为电泳槽没有组装好,电流没有形成通路。包括:一。内外罐装反;湾。外罐液体太少;C。电泳槽底部的绝缘体没有去掉(如灌胶的胶皮)。

解决方法:电泳槽可以正确组装。

Q:浓缩胶和分离胶破裂,板间有气泡会影响电泳吗?

A:这个主要针对初学者,一般对电泳影响不大。前者主要是拉梳子用力不均或过大造成的;后者是由于制胶夹松开后,版材压紧不紧,有空气进入造成的。

    TAG:聚丙烯酰胺 电泳 蛋白电泳

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