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掌握垂直板型电泳的基本操作技术的基本原理的原理是什么
发布时间:2022-01-27 11:14:42 浏览 167次 巩义市维纳净水材料有限公司

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1. 了解SDS-PAGE测定蛋白质分子量的基本原理。

2、掌握垂直板电泳的基本操作技术。

二、原理:

从实验 15 可知,当蛋白质在 聚丙烯酰胺 凝胶中电泳时,其迁移率取决于其净电荷以及分子大小和形状等因素。

1967年等人发现如果在凝胶体系中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠( ,简称SDS),蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量,与电荷和形状无关. 在一定条件下,蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系可用下式表示:

因此,要确定蛋白质的分子量,只需将其迁移率与 SDS 凝胶电泳中一系列已知分子量的蛋白质进行比较即可。后来,等人基本按照该方法研究了大约40种蛋白质,进一步证实了该方法的可行性(见图16-1)。用该方法测定蛋白质的分子量简单、快速,而且价格便宜需要仪器和微克量的蛋白质样品;在15,000-200,000的分子量范围内,得到的结果一般在用其他方法测得的分子量的±10%以内。因此,近年来,SDS-凝胶电泳的方法测定分子量已得到广泛应用和迅速发展。

为了阐明SDS-凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理,许多人进行了深入的研究。实验表明,在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后,巯基乙醇可以还原蛋白质分子中的二硫键;SDS可以打开蛋白质的氢键和疏水键,与蛋白质分子结合形成蛋白质-SDS。复杂的。在某些条件下,SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4 g SDS/1 g 蛋白质。由于十二烷基磺酸盐的负电荷,各种蛋白质的SDS-配合物都带有相同密度的负电荷,其数量大大超过蛋白质分子的原始电荷,从而掩盖了不同类型蛋白质的起源。一些费用差异。

SDS与蛋白质结合后,也会引起蛋白质构象的变化。蛋白质-SDS复合物的流体动力学和光学性质表明,它们在水溶液中的形状类似于雪盒烟雾形状的长椭圆棒。然后轴与蛋白质的分子量成比例地变化。

这种蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只是椭圆杆长度的函数,也是椭圆杆分子量的函数。蛋白质。

蛋白质-SDS复合物在不同浓度的SDS-gel中进行电泳,所得结果按公式作图,也证明了蛋白质-SDS复合物的上述性质。

公式:1gm R=1gm0—KRC

这个公式最初是为了描述蛋白质在淀粉凝胶中的电泳行为而提出的,后来证明它也适用于凝胶电泳聚丙烯酰胺,其中 m R 是蛋白质在一定浓度凝胶中的迁移量(C ) m0 是凝胶浓度外推为零时的迁移率,即自由迁移率,它与蛋白质的净电荷 (q) 成正比,与溶液中蛋白质的摩擦系数 (f) 成反比 ( m0∝q/f,f由溶液的粘度、蛋白质分子的大小和形状决定);KR 是延迟系数 ( ),它与蛋白质分子量呈线性关系。因此,不同的蛋白质分子具有不同的mR、m0和KR值,几种蛋白质的图形如图16-2所示。

蛋白质-SDS 复合物的图谱不同(见图 16-3).

从图16-3可以清楚地看出,不同蛋白质的SDS复合物的m0值非常接近,分子量相差5倍的蛋白质的m0值仅相差10%。如果忽略这个差异,可以认为每个蛋白质-SDS复合物的m0基本上是一个常数值。这表明不同蛋白质的SDS复合物都带有相同密度的负电荷,具有相同的构象。因此,它们的净电荷与摩擦系数的比值(q/f)接近于一个恒定值,而不受原始电荷、各种蛋白质分子大小和形状的影响,因此,在溶液中,自由流动性表现出一致性;但在一定浓度的凝胶中,由于凝胶的分子筛效应的引入,

基于以上事实,可以认为SDS-凝胶电泳测定蛋白质分子量方法的依据是可靠的。当然,还有很多问题需要深入研究。

SDS-凝胶电泳测定蛋白质分子量时,应注意以下问题:

1. 如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4 g SDS/1 g蛋白质的比例并且具有相同的构象,则无法获得准确的结果。影响蛋白质与SDS结合的主要因素有3个:(1)二硫键是否完全还原:只有当蛋白质分子中的二硫键完全还原时,SDS才能与蛋白质定量结合。某些情况下,形成的硫醇基团需要进一步烷基化以避免在电泳过程中再次氧化形成蛋白聚集体。(2)溶液中SDS的浓度:溶液中SDS的总量至少为3比蛋白质的量高几倍,一般需要高达10倍以上。(3)溶液的离子强度:溶液的离子强度应该更低,最大不能超过0.26,因为SDS在水溶液中以单体和分子基团的混合物形式存在,与蛋白质分子结合的SDS量只取决于SDS 单体处于平衡状态 SDS 单体在低离子强度溶液中的平衡浓度高于总浓度。2. 不同的凝胶浓度适用于不同的分子量范围,实验表明在5%的凝胶中,对于分子量为25,000-200,000的蛋白质,分子量的对数与迁移率呈线性关系;在 10% 的凝胶中,与蛋白质分子结合的 SDS 的量仅取决于平衡时的 SDS 单体 SDS 单体在低离子强度溶液中的平衡浓度高于总浓度。2. 不同的凝胶浓度适用于不同的分子量范围,实验表明在5%的凝胶中,对于分子量为25,000-200,000的蛋白质,分子量的对数与迁移率呈线性关系;在 10% 的凝胶中,与蛋白质分子结合的 SDS 的量仅取决于平衡时的 SDS 单体 SDS 单体在低离子强度溶液中的平衡浓度高于总浓度。2. 不同的凝胶浓度适用于不同的分子量范围,实验表明在5%的凝胶中,对于分子量为25,000-200,000的蛋白质,分子量的对数与迁移率呈线性关系;在 10% 的凝胶中,分子量的对数与迁移率呈线性关系;在 10% 的凝胶中,分子量的对数与迁移率呈线性关系;在 10% 的凝胶中,

10.000—70,000分子量的蛋白质呈线性关系;在 15% 的凝胶中,10,000-50,000 分子量的蛋白质呈线性关系;3.33%(以上各种浓度的凝胶,交联度2.6%的凝胶)可用于更高分子量的蛋白质。

可根据测定的分子量范围选择最佳凝胶浓度,应尽量选择分子量范围和性质与待测样品相似的蛋白质作为标准蛋白质。标准蛋白的相对迁移率(蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率,详见下文)0.2—0.之间最好均匀分布8.

在凝胶电泳中,影响迁移率的因素很多,在凝胶制备和电泳过程中,很难控制每次条件完全一致。因此二维聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-凝胶电泳用于确定分子量。同时测定的每个样品必须制作标准曲线,不得使用另一条电泳的标准曲线。

3、有许多蛋白质由亚基(如血红蛋白)或两条以上的肽链(如α-胰凝乳蛋白酶)组成,在SDS和巯基乙醇的作用下解离成亚基或单肽链。因此,对于这类蛋白质,SDS-凝胶电泳仅确定其亚基或单个肽链的分子量,而不是完整分子的分子量。为了获得更全面的信息,必须采用其他方法确定其分子量和分子中肽链的数量,并与SDS-凝胶电泳的结果相互参照。

4. 不是所有的蛋白质都可以用SDS-凝胶电泳测定,而且已经发现有些蛋白质用这种方法测定的分子量不可靠。这些蛋白质包括:带异常电荷或异常构象的蛋白质、具有较大辅基的蛋白质(如一些糖蛋白)和一些结构蛋白如胶原蛋白。比如组蛋白F1本身就带有大量的正电荷,所以虽然结合了正常比例的SDS,但并不能完全掩盖其原有正电荷的作用。其分子量为21,000,但SDS-凝胶电泳测定结果却为35,000。因此,在分析 SDS 凝胶电泳获得的结果时应小心。一般来说,至少有两种方法用于确定未知样品的分子量并相互验证。为了确定待测样品是否可以通过SDS-凝胶电泳确定,也可以将蛋白质-SDS复合物在不同浓度(交联度相同)的SDS-凝胶中电泳,得到图形。如果待测样品的自由迁移率 m0 与标准蛋白的 m0 基本相交于一点(如图 16-3),在不同浓度的 SDS-gel 下测得的分子量为同,表明蛋白在SDS-gel电泳中的行为是正常的,可以通过SDS-gel电泳测定其分子量。为了确定待测样品是否可以通过SDS-凝胶电泳确定,也可以将蛋白质-SDS复合物在不同浓度(交联度相同)的SDS-凝胶中电泳,得到图形。如果待测样品的自由迁移率 m0 与标准蛋白的 m0 基本相交于一点(如图 16-3),在不同浓度的 SDS-gel 下测得的分子量为同,表明蛋白在SDS-gel电泳中的行为是正常的,可以通过SDS-gel电泳测定其分子量。为了确定待测样品是否可以通过SDS-凝胶电泳确定,也可以将蛋白质-SDS复合物在不同浓度(交联度相同)的SDS-凝胶中电泳,得到图形。如果待测样品的自由迁移率 m0 与标准蛋白的 m0 基本相交于一点(如图 16-3),在不同浓度的 SDS-gel 下测得的分子量为同,表明蛋白在SDS-gel电泳中的行为是正常的,可以通过SDS-gel电泳测定其分子量。

SDS-PAGE有连续系统和不连续系统两种。这两个系统都有各自的样品溶解液和缓冲液,但样品的加入方法、电泳过程和固定、染色和脱色方法完全一样。

三、材料和试剂:

1.设备:

①夹心立板电泳槽、胶模(135×100×1.5mm)(维纳净水材料)

②直流稳压电源(电压300-600V,电流50-)

③ 移液器(1、5、10 毫升) ④ 烧杯(25、50、100 毫升)

⑤ 细尖滴管 ⑥ 1ml 注射器和 6 号长针头

⑦微量注射器(10μl或50μl) ⑧水泵或油泵

⑨真空干燥机⑩培养皿(直径)

2. 试剂:

(1)标准蛋白

目前国内外有生产用于SDS-PAGE测定未知蛋白分子量的低分子量和高分子量标准蛋白试剂盒。

①高分子量标准蛋白试剂盒(公司产品二维聚丙烯酰胺凝胶电泳,表中16-1)。

表 16-1 5 标准蛋白

同时,处理手册的要求

②低分子量标准蛋白试剂盒,中科院上海生化研究所维纳净水材料(表

16-2)。

表 16-2 5 种标准蛋白

每种蛋白质的含量为 40 μg。使用时加入200 μl样品溶解,处理后上样10 μl(2 μg)样品即可显示清晰条带。

③自行配制低分子量或高分子量标准蛋白混合试剂。如果没有标准蛋白试剂盒,可以参考常用标准蛋白及其分子量表。选择马心细胞色素C(Mr12 500)、牛糜蛋白酶A(Mr25 000)、猪胃蛋白酶(Mr35 000))、鸡蛋卵清蛋白( Mr43 000)、牛血清白蛋白(Mr67 000)等蛋白质,按每种蛋白质样品溶解0.5—1mg·ml-1 可配制成单一蛋白质标准溶液或混合蛋白标准溶液。

(2)连续系统SDS-PAGE相关试剂

①0.2mol·L-1pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸氢二钠(AR)·.63g或

·.58g,然后称取磷酸二氢钠(AR)·H2O7.73g 或

·.74g,溶解在再蒸馏水中并定容。

②样品溶解液:0.·L-1pH7.2磷酸盐缓冲液,含1% SDS、1%巯基乙醇、10%甘油或40%蔗糖和0.02%BPB。用于溶解待测标准蛋白和固体蛋白样品。制备方法见表16-3。

表 16-3 连续系统样品溶液的制备

如果样品是液体,请使用两倍浓度的样品溶液,然后等体积混合。

③凝胶保存液:称取Acr 30g,Bis 0.8g,加蒸馏水,过滤后装入棕色瓶中,4℃保存1-2个月。

④凝胶缓冲液:称取SDS 0.2g,加入0.2mol·L-1 pH7.2磷酸盐缓冲液。在 4°C 下储存,使用前稍微加热以溶解 SDS。

⑤1%:取,加蒸馏水,4℃棕色瓶中保存。

⑥10%过硫酸铵(AP):称重AP1g,加入蒸馏水,每周复溶,置于棕色瓶中,4℃保存。

⑦ 电极缓冲液(0.1%SDS,0.1mol·L-1 pH7.2磷酸盐缓冲液):称重,加入0.2mol·L-1 pH7.2磷酸盐缓冲液,然后用蒸馏水定容。

⑧1%琼脂(糖):称取1g琼脂(糖),加入上述电极缓冲液溶解,4℃保存。(3)不连续系统SDS-PAGE相关试剂

①10%(W/V)SDS溶液:称重,加蒸馏水至50ml,微热溶解,放入试剂瓶中,4℃保存。SDS低温易结晶,使用前微热即可完全溶解。

②1%(V/V):取,加蒸馏水,装入棕色瓶中,4℃保存。

③10% AP(W/V):称取AP1g,加蒸馏水至10ml。最好在使用前做好准备。

④样品溶液:1% SDS、1% 巯基乙醇、40% 蔗糖或20% 甘油、0.02% 溴酚蓝、0.·L-1 pH8. 0 Tris-HCl 缓冲液。

●先准备0.·L-1 pH8.0 Tris-HCl缓冲液:称取Tris 0.6g,加入50ml双蒸水,再加入约

3ml 1mol·L-1 HCl,调节pH至8.0,最后用重蒸水定容。

●按表16-4制备样品溶液。

表 16-4 不连续系统样品溶解液的制备

*如果样品是液体,使用两倍浓度的样品溶液,然后等体积混合。

⑤凝胶储存液

●30%分离凝胶原液:制备方法与连续系统相同。称取Acr 30g 和Bis 0.8g,溶于重蒸水中,定容至终体积,过滤后储存于棕色试剂瓶中,4°C 保存。

●10%浓缩凝胶原液:称取Acr 10g和Bis 0.5g,溶于双蒸水中,定容至终体积,过滤后放入棕色试剂瓶中,4℃保存。

⑥ 凝胶缓冲液

●分离凝胶缓冲液(3.0mol·L-1 pH8.9 Tris-HCl缓冲液):称取Tris 36.3g,加少许蒸馏水溶解,再加入约48ml 1mol·L-1 HCl,调节pH至8.9,最后加入蒸馏水定容,4℃保存。

●浓缩胶缓冲液(0.5mol·L-1 pH6.7 Tris-HCl缓冲液):称取0.0g,加少许重蒸水溶解,加入1mol·L-1约48ml将 HCl 调节至 pH 6.7。最后,用再蒸馏水定容并在 4°C 下储存。

⑦ 电极缓冲液(含0.1% SDS,0.·L-1 Tris—0.384 mol·L-1甘氨酸缓冲液pH8.3):称取0.0,甘氨酸28.8g,加1g SDS,加蒸馏水溶解,定容。

⑧1%琼脂(糖)溶液:称取1g琼脂(糖),加入电极缓冲液,加热溶解,4℃保存备用。

(4)固定剂

取 50% 甲醇和 46 ml 冰醋酸并混合。

(5)染色液

称它为考马斯亮蓝R250 0.125g,加入上述固定液,过滤后涂抹。

(6)脱色液

冰醋酸75ml,甲醇50ml,加蒸馏水定容。

四、操作步骤:

(一)夹层立板电泳槽安装

托式立板电泳槽操作方便,不易渗漏,其装置如图16-4所示。该电泳槽两侧为有机玻璃电极槽,两个电极槽之间夹有凝胶模具。该模具由成型的硅胶框架、长短玻璃板和

样品槽模板(梳状)由(见图16-5)组成。电泳槽由上槽(铂电极在顶部或面对短玻璃板)和下槽(铂电极在底部或面对长玻璃板)板)和冷凝冷凝管。两个电极槽和凝胶模具由储液槽螺钉固定。零件按以下顺序组装:

2、将长玻璃板和短玻璃板分别插入硅橡胶边框的凹槽中。注意不要用手触摸灌封面上的玻璃。

3、将插好玻璃板的凝胶模具平放在上槽上,短玻璃板应朝向上槽。

4、将下水箱的销孔对准已安装螺丝销的上水箱,用双手对角拧紧螺丝帽。

5、在立式电泳槽中,将融化的1%琼脂(糖)加入长玻璃板下端与硅胶模框之间的缝隙中。其目的是密封间隙,凝固的琼脂(糖)中应避免气泡。

(二)凝胶制备和凝胶板制备

1.用胶水

根据待测蛋白的分子量范围选择合适的分离胶浓度。由于SDS-PAGE有连续体系和不连续体系两种,两种缓冲体系不同,所以制备方法也不同,见表16-5和表16-6。表 16-5 SDS-不连续系统凝胶制备

电极缓冲液是含有 0.1% SDS 的 pH8.-甘氨酸缓冲液。

电极缓冲液为 0.1mol·L-1 pH7.2 磷酸盐缓冲液,含有 0.1% SDS。

2. 凝胶板的制备

(1)SDS-不连续系统凝胶板的制备

●分离胶的制备:按表16-5制备%分离胶。混合后,用细长滴管将凝胶溶液加到长短玻璃板之间的缝隙中,高约8cm,用1ml注射器取少量蒸馏水沿长玻璃板壁缓慢注入,约3-4mm 高,用于防水密封。大约之后,凝胶与水封层之间出现一条不同折射率的边界线,表明凝胶已完全聚合。倒掉水封层的蒸馏水,然后用滤纸条吸去多余的水分。

●浓缩胶的制备:按表16-5制备%浓缩胶。混合后,用细长的滴管在聚合分离凝胶的顶部添加浓缩凝胶,直到距离短玻璃板的上边缘约 0.。5cm,将样品槽模板轻轻插入浓缩胶中,约5cm后凝胶会聚合,然后放置20-使凝胶“老化”。小心拉出样品槽模板,用窄条滤纸吸干样品槽内多余的水分,将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上下储槽中。如果@0.5cm 或更多,您就可以添加样品了。

(2)SDS- Gel 的制备:按表16-6制备所需浓度的分离胶20ml,用细长的移液管将分离胶混合物加入两块玻璃板的间隙中样品槽模板至距离短玻璃板上缘0.5cm,为防止漏液,可在上下电极槽中加入蒸馏水,但不要超过短板为防止凝胶被稀释,约,凝胶聚合,继续静置20-,倒出上下电极罐中的蒸馏水,小心拉出梳状样品罐模板,使用窄条过滤器用纸吸去残留的水分,注意不要弄破凹入的样品槽底面。倒入电极缓冲液进行预电泳或准备上样。

(三)样品处理和装载

1. 样品处理

根据分子量标准蛋白试剂盒的要求加入样品溶解液,如上海维纳净水材料生产的低分子标准蛋白试剂盒,每支安瓿需要加入200 μL的样品溶解液,配制好标准样品和未知样品自行处理。

按 0.5-1mg/1mL 样品溶解溶液,溶解后,将其转移到带塞子的小离心管中,轻轻

轻轻盖上盖子(不要塞得太紧,以免过热),并在100°C沸水浴中保持3分钟。

取出冷却并加入样品。如果处理后的样品暂时不使用聚丙烯酰胺价格,可以在-20°C的冰箱中保存更长的时间。

长时间使用前在100℃沸水中加热3min,以去除亚稳态聚合。

2、添加示例

一般情况下,每个凹形样品槽只加入一个样品或已知分子量的混合标准蛋白。

应根据凝胶厚度和样品浓度灵活控制样品体积。一般样本量为

10-15μL(即2-10μg蛋白质)。如果样品被稀释,样品体积可达 100 μL。喜欢

样品罐内有气泡,可用注射器针头拾取。加样时,将微量注射器的针头通过电极缓冲液插入加样罐,尽量靠近底部,轻轻推动微量注射器。注意不要破坏凹槽的橡胶表面。由于样品溶液中含有比重较大的蔗糖或甘油,样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。

(四)电泳

脉冲聚合分离后是否进行预电泳应根据需要确定。SDS连续系统的预电泳采用

——。

1.连续系统

将0.1%SDS pH7.2 0.1mol/L磷酸盐缓冲液倒入电极槽中,将电泳仪与电泳槽连接,上槽接负极,下槽接正极。打开电源,将电流调整为 20mA。样品进入分离胶后,调节电流至50mA。当染料前沿迁移到距硅橡胶框底边1—1.5cm时,停止电泳。一般需要5—6h。

2. 不连续系统

将含有 0.1% SDS 的 pH8.-HCl 电极缓冲液倒入电极槽中进行电泳。制备浓缩胶后,不能进行预电泳,因为预电泳会破坏pH环境。如有必要,只能在分离胶聚合后进行电泳,并使用分离胶缓冲液。预电泳后,在制备浓缩胶之前冲洗分离胶表面。电泳条件也不同于连续 SDS-PAGE。开始时,电流约为 10mA。样品进入分离胶后,变为20-30mA。当染料前沿距离硅橡胶框底边1.5cm时,停止电泳并关闭电源。

(五)凝胶板剥离固定

电泳结束后,取下凝胶模具,取下硅橡胶框,用不锈钢刮刀或镊子撬开短玻璃板,在凝胶板上切一角作为上样标记,将溴酚蓝染料中心放置两侧的区域。, 插入一根细铜线作为前沿标记。将凝胶板放在一个大培养皿中,加入固定剂,然后固定溶液。

(六)染色和脱色

将染色液倒入培养皿中,染色约1小时,用蒸馏水冲洗数次,再用脱色液脱色至蛋白区清晰,即可计算相对迁移率。

(七)结果与分析

1.绘制标准曲线

将大培养皿放在一张方格纸上,测量样品端与细铜线的距离(cm)和每个蛋白样品区中心与样品端的距离(cm),如图图 18-6。计算相对迁移率 m R 如下:

以标准蛋白的相对迁移率为横坐标,标准蛋白的分子量为纵坐标,在半对数坐标纸上作图,即可得到标准曲线。

2. 根据未知蛋白质样品的相对迁移率,在标准曲线上直接测定其分子量。

3. 分析每种蛋白质的相对迁移率主要由什么决定?

预防措施

(1)由于与凝胶聚合有关的硅橡胶垢和玻璃板表面不光滑清洁,凝胶板在电泳时会从玻璃板或硅橡胶条上剥落,产生气泡或滑胶;凝胶板容易断裂,为防止出现拉扯现象,所用设备应严格清洗干净。用泡沫海绵仔细清洗。玻璃板用重铬钾酸洗液或0.2mol/L KOH酒精溶液或以上浸泡3-4小时,用水冲洗干净,然后用泡沫海绵蘸“洗干净”反复刷洗,最后用蒸馏水冲洗干净,直接在阴凉处晾干或使用乙醇冲洗后在阴凉处晾干。

(2)长短玻璃板安装电泳槽和硅橡胶框时,位置要正确,固定螺丝要拧紧均匀,避免缓冲液泄漏。样品槽板梳齿应平整光滑。

(3)在不连续电泳系统中,预电泳只能在分离胶结合后进行。浓缩胶清洗干净后可以制备浓缩胶。浓缩胶制备好后,不能进行预电泳。充分利用浓缩胶的浓缩效果。

(4)电泳时,电泳仪与电泳槽之间的正负极不能接错,以免样品反方向移动。电泳时应使用合适的电流和电压.过高或过低都不会影响电泳效果。

(5)SDS纯度:在SDS-PAGE中需要高纯度的SDS,市售的化学纯SDS需要重结晶一到两次才能使用。重结晶方法如下:称取20g SDS放入圆底烧瓶中加入无水乙醇和约半角勺活性炭,在烧瓶上连接冷凝管,在水浴中加热至乙醇微沸,回流约10分钟,趁热过滤热布氏漏斗,滤液透明,冷却至室温后移至-20℃冰箱过夜,次日用预冷布

用漏斗过滤,白色沉淀用少量预冷的-20℃无水乙醇洗涤3次,尽可能干燥。在真空干燥器或低于 40 °C 的烘箱中干燥白色晶体。

(6)当蛋白质样品用SDS处理时,每次将它们在沸水中孵育3-5分钟,以避免亚稳态聚合物的存在。

(7)@​​>标准蛋白的相对迁移率优选均匀分布在0.2—0.8之间。值得指出的是,每次测定未知物质的分子量时,应同时使用。标准蛋白制作标准曲线,而不是使用过去的标准曲线。这种方法测定的分子量只是其亚基或单肽链的分子量,而不是完整的分子量。为了测量一个准确的分子量范围,最好用其他测定蛋白质分子量的方法进行校正。这种方法对球蛋白和纤维状蛋白分子量的测定较好,但糖蛋白和胶原蛋白是完全不同的。

(8)对样品的要求:应使用离子强度低的样品。如果样品中的离子强度高,则应进行透析或离子交换脱盐。加样时,凹面加样的橡胶表面罐应保持平直,加样量应为10-15μL,如果样品是比较稀的液体,为了保证清晰的区域,可以增加加样量,加样浓度(9)由于凝胶中含有SDS,直接制备干板会产生裂纹。如果需要干板,将其浸泡在含7%乙酸的25%异丙醇中,然后更换中频直到 SDS 完全去除(准备干板大约需要 2-3 天。为方便起见,照相法常用于保存照片。

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