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SDS--PAGE的原理是什么在蛋白质样本添加一种还原剂
发布时间:2022-01-27 17:33:50 浏览 276次 巩义市维纳净水材料有限公司

什么是SDS-PAGE

- ,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),作为一种聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,可以测定蛋白质的分子量,分离、分析、纯化、定性、定量和微量准备。

SDS--PAGE的原理是什么?在蛋白质样品中加入还原剂,如巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT),肽片段之间的二硫键会打开蛋白质的高级结构,使所有蛋白质都处于一级结构,而它们的高级结构不再影响蛋白质迁移;蛋白质样品中加入SDS去垢剂可使所有蛋白质带负电荷,从而线性化成多肽,而蛋白质本身的正电荷已被中和,不再影响蛋白质的迁移;加工后的蛋白质多肽结构,在外加电场中,向正电平移动。介质是聚丙烯酰胺凝胶。此时,

SDS-PAGE样品前处理还原剂

在蛋白质的二级结构中,半胱氨酸之间的肽链之间的交联形成二硫键,这需要使用还原剂来破坏二硫键,如巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT),否则会影响蛋白质分离。因此,在制备蛋白质样品时,应加入还原剂,以消除样品间二级结构差异的影响。

十二烷基硫酸钠 (SDS)

蛋白质经还原剂处理后解聚成一级结构,再经SDS处理。所有蛋白质的正电荷都被屏蔽,都带有负电荷。当施加电压时,所有蛋白质都向凝胶的阳极迁移。不同大小的蛋白质会带上与其分子量成正比的负电荷,它们仅根据其分子量来区分,而不是根据它们带电的多少或蛋白质构象来区分。SDS 也存在于凝胶中,以确保所有蛋白质在整个凝胶中保持负电荷。

溴酚蓝 (BPB)

在 BPB 与样品蛋白质混合后,上样样品。当电泳开始时,BPB 会随着蛋白质迁移以检测蛋白质样品的迁移。BPB本身带负电荷,因此也向阳极移动,但它的移动速度比样品中的任何蛋白质都快,到达凝胶末端的速度更快,因此可以作为样品电泳过程的参考。但是,在蛋白质电泳中,标准品会被添加到第一泳道,因此它也可以用于监测电泳过程。

聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺凝胶是通过使用少量交联剂(如 N,N'-亚甲基双丙烯酰胺)在水中聚合单体丙烯酰胺形成的。因此,丙烯酰胺()和双丙烯酰胺(Bis-)共聚,在丙烯酰胺的直链和双丙烯酰胺之间形成三维网络结构,供蛋白质分子通过中间。丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例决定了凝胶的孔径。因此,在一个不连续的凝胶体系中,会有不同浓度和pH值的凝胶堆积和分离。

*其他交联剂:

² 二丙烯酸哌嗪 (PDA) – 可用于降低 SDS-PAGE 凝胶的银染背景;

² N,N'- 酒石酸二丙二醇酯 (DATD)——一种分解凝胶的交联剂

可溶性试剂;

过硫酸铵 (APS) 和

凝胶的聚合通过自由基机制发生。(N,N,N,N-四甲基乙二胺)作为催化剂产生硫酸根。过硫酸铵提供自由基形成硫酸盐基团。这些用于自由基生成的硫酸盐由过硫酸铵提供。

浓缩胶在SDS-PAGE凝胶电泳中的作用

浓缩胶实际上起到了堆积的作用。凝胶浓度小二维聚丙烯酰胺凝胶电泳,孔径大。处理过的蛋白质样品通过大孔凝胶的迁移被浓缩到一个狭窄的区域。在电泳过程中,可以看到样品被挤压。线,以便电泳可以同时启动并位于分离凝胶中。

2个分子参与其中:

来自 Tris-Gly 运行缓冲液的甘氨酸分子,然后是来自具有牵引力的 Tris-HCL 运行缓冲液中的氯离子

*原则是:

缓冲体系中的弱酸,如甘氨酸,在pH6.7时很少解离,其有效迁移率很低;氯离子迁移率高二维聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质迁移率介于两者之间。之间。施加电压后,作为前导离子的氯离子和作为尾随离子的甘氨酸离子被分离,在它们后面留下一个电导率较低的区域。样品混合物中的所有蛋白质都存在于甘氨酸分子(最慢)和氯离子(最快)之间。样品分子在氯化物和甘氨酸之间迁移,并逐渐压缩成非常薄且透明的蛋白质层,以便以后更好地分离蛋白质。

分离胶的作用

分离胶是指不连续缓冲体系聚丙烯酰胺凝胶电泳的一部分,其组成、缓冲液pH和凝胶孔径不同于浓缩胶,是一种具有分子筛作用的小孔径凝胶。

当到达分离胶时阴离子聚丙烯酰胺,pH值升高,孔径急剧减小。在较高的 pH 值下,甘氨酸分子不再以两性离子的形式存在,它们在这个阶段离子化并开始比它们在浓缩凝胶中更快地迁移。氯离子 Cl- 将很快向阳极迁移。因此,一旦蛋白质没有堆积起来,甘氨酸分子很快就难以与样品蛋白质分子结合,蛋白质分子在电流的作用下开始根据分子量自由分离。

SDS-PAGE 的工作流程

根据蛋白质分子量大小,配制相应浓度的分离胶。(按顺序加入各试剂,加入后即开始聚合,混合后立即进入下一步。)首先,将分离胶注入两块玻璃板之间的空隙中,留出注入浓缩胶的空间(根据梳子的长度添加 1 厘米)并在顶部添加一层双蒸水。分离胶聚合完成后,除去上层双蒸水,洗涤上层分离胶,用吸水滤纸吸干上层蒸馏水。准备5%浓缩胶(依次加入各组分后,加入后开始聚合),加到分离胶上层,并小心插入梳子。当浓缩凝胶聚合时,拉出梳子并用双蒸水冲洗残留物。将凝胶固定在电泳仪上,内槽加入新配置的Tris-HCl甘氨酸电泳缓冲液,外槽也​​加入缓冲液,使内外槽不能互通。将蛋白质和 5x 上样缓冲液充分混合,煮沸 3-5 分钟,离心沉淀杂质。将上述蛋白样品加入上样孔,施加100v电压,BPB电泳至分离胶底部。内槽加入新配置的Tris-HCl甘氨酸电泳缓冲液,外槽也​​加入缓冲液,使内外槽不能互通。将蛋白质和 5x 上样缓冲液充分混合,煮沸 3-5 分钟,离心沉淀杂质。将上述蛋白样品加入上样孔,施加100v电压,BPB电泳至分离胶底部。内槽加入新配置的Tris-HCl甘氨酸电泳缓冲液,外槽也​​加入缓冲液,使内外槽不能互通。将蛋白质和 5x 上样缓冲液充分混合,煮沸 3-5 分钟,离心沉淀杂质。将上述蛋白样品加入上样孔,施加100v电压,BPB电泳至分离胶底部。

*5x :Tris base 15.1g;甘氨酸94g;SDS % (w/v);用双蒸水定容至 1L;PH 8.3

    TAG:氨基乙酸 聚丙烯酰胺凝胶 蛋白质结构

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